荧光成像 失败原因与成功诀窍
荧光显微镜的采用可以众多专业化技木，若要一般正确熟记可以花更多的时光。所以，一旦正确熟记观看时的一般拍照技巧具体方法及基础上性的关键点，尽管不清楚荧光显微镜的工作原理，能不能够兑换更准的科学试验参数。底下，体系结构荧光激光散斑中易堕入不了的例子，汇总在多日光内便捷拍照技巧的关键点。何谓荧光成像
荧光成像（Fluorescence imaging）是指，对无法直接观察的无色透明的细胞器官或特定蛋白质，通过荧光标记试剂或荧光抗体进行荧光标记从而实现可视化的手法，由此能够对细胞或蛋白质的形态或结构、生命活动进行观察与分析。
荧光试剂或抗体经过特定波长光（激发光）的照射后具有发光特性，通过荧光显微镜或激光共焦显微镜进行观察。
从可进行活细胞的实时观察♏到分子级别或细胞级别各种各样的实验，大量的生物实验均基于荧光显微镜的使用。另一方面，使用荧光显微镜♓进行分析或评价的结果会因选择的相机、物镜以及光源等的不同而产生差异。
荧光成像失败事例1：对焦失败
对焦是高倍显微镜的决定性的基础运营。根据关察精确度的焦正等轴测图图相才华做好精确度的科学试验好评，图相（Figure）的口感几乎几乎以内文章可以遭受到重视。1，说明怎么写外景旅拍对焦精确度的不清图相外景旅拍的关键。要点1：确认使用的物镜是否合适
要去电子显微镜观测植物肯定学习观测植物作用与物镜基本特征是完全一致。尤其是在荧光观测植物中为重要的是数量直径（NA），数量直径越大，越能提高明净，常见现象下，数量直径越大辩认率也越高，可提高精巧的图片，但在另外一只工作方面，景深（Depth of Field：DOF）则变浅，被摄物质的可视对焦规模缩窄。除此外，物镜亮度对比度或观测植物距離也需求需要考虑，这一些基本特征间的关于的关系相应图下图。| 分辨率 | NA | 观察距离 | 景深 | 亮度 |
|---|---|---|---|---|
| 高 | 大 | 短 | 浅 | 亮 |
| 低 | 小 | 长 | 深 | 暗 |
另外还有需要盖板玻璃校正*1及校正环调整*2的物镜、专用于特殊观察方法的光学设计物镜等各种各具特点的物镜*3。根据观察方法选择合适的物镜尤为重要。
*1 盖板玻璃校正：
盖板玻璃校正物镜设有盖板玻璃校正值。正常情况下，盖板玻璃使用0.17 mm，塑料培养皿为1.2 mm，不使用盖板玻璃时使用🎐0 mm物镜。
*2 校正环调整：
高倍率物镜中还有外壳部分带有校正环（类似🔥表盘）的部件。根据盖板玻璃的厚度调整校正环，分辨率可变化数倍，使用前ꦅ请务必确认校正环的状态。
*3 物镜的特点：
按照🍰观察方法，有时需要符合观察方法的特定光学设计物镜。包括相差、微分ꦚ干涉、偏光、荧光、油镜等。请确认物镜种类。
要点2：从低倍率向高倍率调整物镜
要点3：由近及远查找焦点位置
荧光成像失败事例2：荧光信号过暗，对比度不足
在荧光三维成像中至关重要的的是得制定目标荧光原子或荧光核营养素的电磁波明白因而的图片。因为这，至关重要的的既是物镜，也有与手机拍照或滤光片、面光源等各类摸块的整合，这样整合搭建不成功，会使图片的荧光电磁波过暗、做饱和度过低，因此难于考察。后面，阐明得明白图片需提交掌控的基本知识。要点1：使用适合观察的相机
相机也有很多种类，下面介绍广泛用于荧光显微镜的CCD相机的特点。
荧光观察中重要的是S/N比（信号与干扰的比率）足够高，因此在下表中合适的是黑白制冷CCD相机。
| 彩色 | 黑白 | |
|---|---|---|
| 非制冷 |
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| 制冷 |
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*1 可见光：
一般是指波长大约为400至700 nm的光。彩色相机的显示与人眼相同，会切断波长长度700 n🎃m以上的光。因此无法观察。
*2 暗电流和制冷：
CCD相机内部在没有输入光的状态下也会产生叫作“暗电流”的信号，是造成干扰的原因。曝光时间越长受光元件的温度越高，干扰也变大，通过�▨�冷却相机可抑制干扰。
要点2：使用调节亮度功能
亮度转换转换性能有各种各样，在单反相机添加中常见的转换手段是以下3个产品。认为等显著特点并炉火纯青地识别用对荧光激光散斑比较极为重要。- 曝光时间
- 快门处于开启的时间。为在此期间积蓄信号，曝光时间越长亮度越高，同时暗电流干扰也会累积从而干扰增多。
- 增益
- 对输入CCD元件的电信号进行电性放大。但是，放大输入信号后，干扰也会同时被放大。分辨率不因增益值而变化。
- Binning（像素融合）
- 将临近的像素视为1个假想像素，提高每个单位像素的接收信号量的功能。由于像素被合并图片整体的像素数减少，分辨率将下降，但不会增加干扰。
要点3：荧光滤光片与试剂的匹配
即使荧光信号明亮而发光，如果滤光片透过率过低，仍无法充分观察信号。重要的是尽量使用透过率高的滤光片。
荧光滤光片由激发滤光片与吸收滤光片、二向色镜共3部分组成。确认激发滤光片是否与试剂的激发🅺光谱重叠，吸收滤光片是否与试剂的荧光光谱重叠。假设加入滤光片上标注470/40时，表示可涵盖470nm±20nm的波长范围。数值数据难以理解时，观察试剂与滤光片的光谱数据来判断是否匹配。各种试剂或滤光片的光谱数据可通过各厂商的网站等确认。
要点4：物镜的选择
荧光手机预警稍弱，或比照度匮乏时，可经由修改NA值更具的物镜，方便更鲜艳地看分析。 NA值越大，越是可以鲜艳地看分析荧光手机预警。物镜的倍数越高，NA值也日趋大，S/N比的提升不是很梦想时，经由便用倍数更快的物镜也可避免故障 。要点5：光源的选择
有些光源没有发出要观察的波长。需要确认使用的光源，了解光源的特点并区分使用。
相比于水银灯或金卤灯是1种光源包含短波长到长波长的𒅌大范围波长，激光或LED是1种光源只发出特定范围的波长，因此需要将多个光源组合使用。信号无法顺利发光时，确认试剂与光源波长的光谱数据。
荧光成像失败事例3：荧光发生淬灭，细胞活性下降
发现淬灭或細胞抗逆性变低的其原因大多都源于激活光会造成的磨损。即便是同样，只不良干扰敏感的激活光，可能会展现淬灭现像，細胞也会受到光渗透性不良干扰而会造成抗逆性变低。要想以防这种现像，前提是必须 妥当“减少激活光屈服效果”。虽然，即便减少了激活光的屈服效果，若长耗时不良干扰激活光，荧光数据信号仍会衰减一直到淬灭，細胞将随着计算期限磨损最终能够逐渐耗尽抗逆性。往往，减少激活光屈服效果的同样，“减短激活光不良干扰耗时”是以防激活光对实验英文不良干扰的决定性两种。要点1：激发光强度下降
降低激发光强度，荧光就会相应地变暗，因此需要提高相机增益或延长曝光时间。但是，提高增益或延长曝光时间，就会增大暗电流的干扰，S/N比变低。
要在抑制淬灭及损伤的同时拍摄S/N比高的图像，需要尽量使用灵敏度高的相机。
要点2：缩短激发光照射时间
要缩短激发光照射时间，需要降低基本的操作时间，因此尽量缩短对焦时间、信号查找所用的时间、设定曝光时间所用的时间等操作所用的时间。
另外，对于手꧙动控制激发光快门开闭的显微镜类型，可能发生忘记关快门而造成长时间持续照射激发光，导致淬灭。因此拍摄结束后或临时停止观察时，及时关闭快门尤为重要。
